血細(xì)胞計(jì)數(shù)原理

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)是一項(xiàng)基本功，對于標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件以及需要定量的實(shí)驗(yàn)來說都關(guān)鍵。這里介紹使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的經(jīng)典方法以及中間一些需要注意的細(xì)節(jié)。
制備細(xì)胞懸液：
對于貼壁生長的細(xì)胞，我們需要使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落
根據(jù)需要加入合適體積的培養(yǎng)基，將細(xì)胞進(jìn)行中和及稀釋，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹打散開，不要?dú)埩羧魏渭?xì)胞團(tuán)
準(zhǔn)備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：
使用70%乙醇將蓋玻片和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器清潔干凈
將將蓋玻片潤濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細(xì)胞計(jì)數(shù)器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上
臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計(jì)算細(xì)胞的活力，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合
室溫孵育3-5分鐘，使臺盼蘭進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色
血細(xì)胞計(jì)數(shù)器加樣：
使用吸管將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺盼蘭混合液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池的邊緣。此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計(jì)數(shù)池
以同樣的方式在另一側(cè)的計(jì)數(shù)池中也加入細(xì)胞懸液
將計(jì)數(shù)板放置幾分鐘使細(xì)胞擴(kuò)散，同時(shí)用吸水紙吸除多余的液體
細(xì)胞計(jì)數(shù)：
在100倍顯微鏡下，移動計(jì)數(shù)板將視野對準(zhǔn)計(jì)數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個(gè)視野
使用手持式計(jì)數(shù)器記錄計(jì)數(shù)池四個(gè)角以及中央方塊內(nèi)的細(xì)胞數(shù)（1-5號位置，經(jīng)典的current-protocol推薦每個(gè)方塊細(xì)胞數(shù)應(yīng)不大于20-50），并重復(fù)記錄另一側(cè)計(jì)數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計(jì)十個(gè)方塊。計(jì)數(shù)的方法是只計(jì)算上邊和左邊壓線的細(xì)胞，而右邊和下邊壓線的細(xì)胞不予計(jì)算（下圖，總體原則是“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右"，判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個(gè)細(xì)胞沒有吹散成團(tuán)存在，此時(shí)只可記為一個(gè)細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞